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本试剂盒提供一整套试剂用于小鼠基因型快速鉴定，包含DNA粗提取及PCR扩增体系，无需繁琐的抽提与纯化步骤，直接进行PCR扩增，极大提升科研效率。试剂盒中的裂解液能够快速裂解小鼠脏器组织、尾巴或耳朵等样本，释放出的基因组DNA无需提纯即可用于PCR扩增。此外，本试剂盒对样品投入量要求低，5mg小鼠组织或1～5mm鼠尾即可进行实验。本试剂盒提供的2×Direct PCR Master Mix包含了除模板和引物外的所有用于PCR的扩增组分，大大简化操作过程，且含有示踪染料，PCR产物可直接电泳。

• 建议使用新鲜采取的动物组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。
  
• 组织应尽量剪碎，以便裂解反应更充分的进行，提高鉴定效率。
  
• Buffer ML的保存条件为2～8℃，若低温保存可能会出现沉淀，在使用前务必充分溶解；
  
• Proteinase K灭活步骤(95℃,5min)必须进行，否则其残留活性会抑制后续PCR反应；
  
• 本制品仅限于科研使用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

• 样本处理：
  
  • 剪取5～10mg动物组织或1～5mm鼠尾，置于1.5mL离心管中；
    
  • 在上述离心管中加入200μL Buffer ML和4μL Proteinase K，轻轻涡旋混匀，并使样品完全被裂解液浸润；
    
  • 在55℃下孵育20min，然后95℃加热处理5min；
    
    • 将组织块全部浸入裂解液中，孵育后组织块可能并未完全消化，是正常现象，不影响后续实验。对于常规大小目标片段，20min孵育已足以释放足量的DNA模板。孵育时间也可根据实际情况进行调整，下表为不同长度的扩增片段在55℃下所推荐的孵育时间：
      

      扩增片段长度	55℃推荐孵育时间
      约500bp	10min
      约1000bp	20min
      约1500bp	30min

  • 将裂解产物涡旋振荡充分混匀后，12000rpm离心2min，取上清即可进行PCR反应，也可以将上清转移至新的离心管，于4℃或-20℃可保存至少3个月。
• PCR扩增：
  
  • 将2×Direct PCR Master Mix解冻完全后，上下颠倒混匀。于冰上配制如下反应体系：
    

    成分	用量
    ddH2O	至50μL
    2×Direct PCR Master Mix	25μL
    裂解产物	2～5μL
    引物F(10μM)	2μL
    引物R(10μM)	2μL

  • 推荐PCR反应条件设置：
    

    步骤	温度	时间	循环数
    预变性	94℃	5min	1
    变性	94℃	30sec	35
    退火	50～68℃	30sec
    延伸	72℃	30sec/kb
    最终延伸	72℃	7min	1

    • 退火温度为60℃可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。PCR反应特异性不高时，可以在55～68℃范围内适当调整退火温度；如果引物Tm值小于63℃，可以将退火温度按Tm值进行设定。
  • 扩增产物直接进行琼脂糖凝胶电泳检测，无需添加DNA Loading Buffer。